Cara Mudah Memahami Metode Spektrofotometri

Spektrofotometri 

Devinisi dari spektrofotometri merupakan suatu metode analisa yang didasarkan pada pengukuran serapan sinar monokromatis oleh suatu lajur larutan berwrna pada panjang gelombang spesifik dengan menggunakan monokromator prisma atau kisi difraksi dengan detektor fototube.  Sedangkan alat yang digunakan dinamanakan Spektrofotometer dengan prinsip kerja mengukur transmitan atau absorban suatu sampel sebagai fungsi panjang gelombang.

Perlu diperhatikan jika ingin menggunakan metode spektrofotometer yang perlu disiapkan adalah: Sampel berupa larutan jernih jika akan menggunakan Spektro UV (190-380 nm) sedangkan Spektro Visibel /cahaya tampak maka mengunakan panjang gelombang (380-780 nm). Bagaimana jika larutannya jernih sedanangkan alat yang tersedia Spektro Vis (380-780) maka larutan tersebut harus dirubah untuk menjadi berwarna. Contoh ingin menetepkan suatu sampel asam salisilat, untuk mengubah warna larutan tersebut maka diubah dengan meneteskan reagen FeCl3. 

Keuntungan metode ini adalah dengan prosedur yang sederhana untuk menetapkan kadar secara kuantitatif untuk sampel yang sedikit dengan hasil yang akurat. Hasil yang didapat berupa angka yang terbaca langsung dicatat oleh detektor dan tercetak dalam bentuk angka atau berbentuk grafik

contoh persiapan sampel

Spektrofotometer UV-Vis digunakan terutama untuk analisis kuantitatif, tetapi dapat juga untuk analisis kualitatif. 

Analisis secara kualitatif seperti:

1. Membandingkan lamda maksimum

2. Membandingkan serapan (A), daya serap (a), enstiti molar

3. Membandingkan spektrum serapan

 Terdapat lima faktor yang mempengaruhi spektrum serapan yaitu jenis pelarut, pH larutan, kadar larutan, tebal larutan, dan lebar celah.

 Analisis secara kuantitatif

Langkah-langkah dalam analisis kuantitatif dengan metode spektro adalah sebagai berikut:

1. Pembuatan spektrum serapan

2. Pembuatan kurva kalibrasi

3. Pembuatan larutan standar, pengenceran sampel

Langkah-langkah yang perlu diperhatikan: 

1.Memilih Kuvet

Dalam pengukuran sampel atau deret baku seri menggunakan alat spektrofotometer jangan sampai salah menggunakan kuvet (wadah sampel). Kuvet harus disesuaikan dengan larutan yang sebelumnya. Jika warna larutan jernih maka pilih kuvet yang terbuat bukan dari kaca. Kuvet untuk larutan jernih yang akan diukur menggunakan spektro Uv maka memakai kuvet kuvet dari bahan silika (kuarsa), kuvet ini hargnya lebih mahal dibanding kuvet kaca. Jika yang diukur larutannya berwrna maka pakailah kuvet berbahan kaca.

Penggunaan Kuvet dan Pengukuran Spektrofotometer

 

2. Pegang teori Hukum Lambert dan Beer

Teori Lambert mengungkapkan serapan berbanding lurus dengan ketebalan lapisan yang disinari (tebal kuvet dan sampel didalam kuvet). Dengan bertambahnya lapisan maka serapan akan bertambah.

Teori Beer mengungkapkan hanya berlaku untuk cahaya yang monokromatis dan larutan yang sangat encer, jika konsentrasi bertambah, jumlah molekul yang dilalui berkas sinar akan bertambah sehingga serapan juga bertambah.

Sehingga kita mengenalnya hukum Lambert-Beer, dengan kesimpulan jika serapan berbanding lurus dengan konsentrasi dan ketebalan lapisan. Hasil absorbansi dari output alat spektro yang sering dipakai adalah nilai Absorbansi. Nilai absorbansi yang memenuhi hukum ini diusahakan sekitar 0,2 -0,8. Jika memakai 5 deret baku seri usahkan nilai absorbansi 0,2-0,8. Jika nilai absorbansinya yang dihasilkan kurang dari 0,2 maka konsentrasi pembuatan baku seri perlu ditingkatkan. Jika nilai absorbansi lebih dari 0,8 misal didapat 1,2 maka seri konsentrasi perlu diturunkan/diencerkan.

3. Penentuan Lamda Maksimum

Lamda maksimum sangat penting dalam pengukuran sebuah sampel. Cari pustaka sebelumnya nilai lamda maksimum kira-kira sampel tersebut lamda maksimumnya berapa, karena setiap literatur dan kenyataan disaat praktikum atau penelitian akan menemukan hasil lamda yang berbeda. Jika kita sudah punya data sebelumnya makan akan mudah menganalisis apakah nilai absorbansi kita sudah tepat apa belum. Ada istilah Batokromik dan Hipsokromik, contoh hasil lamda maksimum pengukuran kafein 274 nm sedangkan di teori lamda kafein 272-276 nm.

Batokromik jika nilai lamda kita yang diperoleh bergeser ke daerah panjang gelombang yang lebih panjang, peristiwa ini disebabkan karena adanya efek subsitusi atau efek pelarut.

Hipsokromik jika nila lamda yang kita peroleh ke daerah panjang gelombang yang lebih pendek.

Alasan kita menggunakan lamda maksimum adalah:

1.Karena pada panjang gelombang maksimum kepekaan metode juga maksimum

2.Karena dengan sedikit berubahnya absorbansi untuk setiap range konsentrasi adalah yang paling besar

3. Jika dilakukan pengukuran berulang maka tingkat kesalahan yang disebabkan oleh pengaturan lamda maksimum minimal

lamda maksimal

 

 

 

4. Pada lamda maksimum akan diperoleh serapan yang maksimum

5.  Pada lamda maksimum bentuk serapan pada umumnya landai sehingga kesalahan penempatan/pembacaan lamda dapat diabaikan, tetapi untuk senyawa yang mempunyai spektrum serapan dengan puncak curam, tidak dianjurkan meggunakan lamda maksimum

Setelah mendapatkan data hasil spektrofotometri maka langkah selanjutnya mengolah data untuk mengahasilkan kurva baku. Data tersebut bisa diolah /dihitung menggunakan kalkulator, memakai microsoft excel ataupun memakai metode SPSS. Jika anda kebingungan mengolah data dengan excel silahkan berkunjung ke cara mudah membuat kurva baku. sudah kami bahas dengan bahasa yang mudah untuk anda pahami.

Pustaka:

Harmita. 2017. Penetapan Kadar Bahan Baku Obat dan Sediaan Farmasi. Jakarta. EGC